草鱼SREBP-1-3'-UTR双荧光素酶报告载体构建及miR-33对其表达的影响

为研究草鱼（Ctenopharyngodon idella）miR-33在固醇调节元件结合蛋白-1（Sterol regulatory element binding protein 1，SREBP-1）调节脂代谢中的作用，构建了草鱼SREBP-1基因3'端非翻译区（Untranslated region，UTR）含miR-33靶序列的双荧光素酶报告基因载体。首先用PCR法获得SREBP-1 mRNA含miR-33结合位点的3'UTR序列（379 bp），与双荧光素酶报告载体pmirGLO重组后转染DH5α感受态细胞。然后经筛选和双酶切鉴定，获得含有SREBP-1基因3'-UTR的双荧光素酶报告载体：pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR。最后在草鱼肝细胞L8824共转染miR-33mimics和pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR，明确miR-33与SREBP-1基因3'UTR区的靶向关系。结果表明，含有SREBP-1基因3'-UTR序列的双荧光素酶报告基因载体构建成功，PCR、双酶切和基因测序证明序列与目标一致；转染pmirGLO-SREBP-1-3'-UTR的L8824细胞可表达荧光素酶，单独转染载体组的荧光素酶活性显著高于共转染载体和miR-33 mimics组（P<0.05）。本研究证实草鱼SREBP-1是miR-33的直接靶基因，miR-33通过和SREBP-1 mRNA 3'UTR结合，调控SREBP-1基因的转录后表达