整合子相关元件多重PCR检测技术建立及其在弧菌中应用

为了建立一种能同时检测1类整合子、4类超级整合子和1型插入序列共同区的多重PCR检测方法，根据GenBank中1类整合子整合酶基因int1、4类超级整合子整合酶基因intSXT和1型插入序列共同区转座酶基因ISCR1的序列，应用PrimerPlex 2.61设计3对特异性引物，通过改变引物浓度和退火温度对多重PCR体系进行了优化。此后，评价了所建立多重PCR体系的特异性和灵敏度，并应用于222株海水养殖源弧菌中3种整合子相关元件的检测。结果显示，设计的3对引物能分别单独且特异性地扩增出569 bp、430 bp和651 bp的目的条带；当int1、intSXT和ISCR13对引物（10 pmol/μL）的体积依次为0.3 μL、0.6 μL和0.6 μL，退火温度为50℃时，多重PCR体系能特异性地扩增出3个条带清晰、区分度良好的目的条带，方法的灵敏度达到0.02 ng/μL弧菌基因组模板DNA；利用所建立的方法对222株临床分离弧菌进行3种整合子元件检测得到的结果与文献报道的单引物检测结果一致。从上述研究结果可以看出，该多重PCR方法能快速准确地检测Int1、SXT和ISCR1，适用于整合子相关元件流行监测及整合子相关的耐药性研究