活性位点邻近的Ω-loop对胰蛋白酶热稳定性和活性的影响 Effects of Ω-Loop Near Active Sites on the Stability and Activity of Trypsin

以猪源胰蛋白酶作为研究对象，尝试利用删除猪源胰蛋白酶活性位点邻近Ω-loop的方法来提高其热稳定性和活性。首先通过Gromacs v4.5.5分子动力学模拟软件，预测出了胰蛋白酶的柔性区Fragment 41~46（即Ω-loop所在区域）。然后根据删除Ω-loop结构中不同的氨基酸数目，确立了三个突变R1Q、K3Q及C5Q；通过重叠延伸PCR技术构建突变菌株，发酵表达后，进行了酶热稳定性和活性分析。结果表明，R1Q、K3Q及C5Q的活性在一定程度上均有提高，在热稳定性上R1Q和K3Q有所提高，C5Q有所下降，其中R1Q 突变体酶的最高活性较野生型提高了1.42倍，同时，失活半衰期和最适反应温度较野生型也分别提高了213.3 min和11.8℃。实验结果证明，在删除该Ω-loop中的异亮氨酸后，得到了突变型R1Q酶，成功实现酶双功能的共同进化。该策略有潜力应用于其他工业酶分子的热稳定性和活性改造，为推动生物酶的工业化应用奠定基础。