小鼠pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建及CD69转基因小鼠的建立

目的:构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)在细胞内核糖体切入位点(IRES)的表达载体pLCK-CD69-IRES-EGFP,并基于此创建CD69转基因小鼠。方法:首先通过小鼠肺组织提取RNA,逆转录成为cDNA,经过PubMed搜索设计PCR引物,PCR法扩增mCD69片断,接着将该DNA片段经测序验证后接入pInsulater-LCK-IRES-EGFP质粒,构建pLCK-CD69-IRES-EGFP转基因载体;再将其转染到293T细胞中,通过荧光显微镜技术确定其在293T细胞中的表达状况;最后将载体显微注射入受精卵并移植入假孕母小鼠,出生小鼠取尾经PCR鉴定获得阳性首建鼠,并通过荧光显微镜和流式细胞术确定淋巴细胞上CD69的表达。结果:经酶切、DNA测序鉴定证实pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建成功;荧光倒置显微镜检查证实其在转染的293T细胞内的蛋白表达;小鼠取尾PCR鉴定明确CD69转基因小鼠创建成功;CD69转基因小鼠有外周血淋巴细胞的减少及静息状态下CD69的表达。结论:成功构建pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体及制备CD69转基因小鼠,为CD69在炎症性疾病中作用的整体模型研究奠定了基础。