茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析

在实验室前期构建cDNA幼根文库获得谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS，EC 6.3.1.2）同源序列（contig48）的基础上设计引物，通过SMART RACE技术克隆了该基因cDNA 全长序列（命名为GS1 2，GenBank登录号: JQ925873.1）。结果显示：（1）GS1 2基因全长为1 710 bp，开放阅读框长1 071 bp, 编码356个氨基酸, 预测蛋白分子质量为39.3 kD, 理论等电点为5.65；核酸序列分析表明，GS1 2基因与从安吉白茶中克隆的茶氨酸合成酶基因相似性为99%。（2）将GS1 2基因克隆至原核表达载体pET 32a和pMAL c5x，转化至大肠杆菌，IPTG诱导表达融合蛋白，SDS PAGE检测结果表明，pET 32a CsGS1 2转至Rosetta中诱导表达的蛋白与预测蛋白大小一致，主要以包涵体形式存在；而pMAL c5x CsGS1 2转化大肠杆菌BL21（DE3）诱导表达可产生可溶性蛋白。（3）进一步构建茶树GS1 2酵母表达载体pYES DEST52 CsGS1 2并转化至酿酒酵母（WAT11）菌液中，添加底物（谷氨酸钠100 μmol/L和盐酸乙胺500 μmol/L）震荡培养并离心，UPLC MS测定酶反应产物结果初步表明，目的蛋白不能催化盐酸乙胺和谷氨酸钠合成茶氨酸，但可以合成谷氨酰胺。