重组抗凝蛋白-新蛭素的原核表达研究

目的:重组新蛭素(eh)是在抗凝蛋白水蛭素的氨基末端添加3个氨基酸(epr)的衍生物,以往eh的表达工艺沿用水蛭素的酵母表达工艺,生产周期长、目标蛋白表达效率相对较低。而水蛭素类的蛋白在大肠杆菌中往往以包涵体形式表达,后期的分离纯化收率较低,无法适应产业化。为了提高eh的生产效率,探索了eh在大肠杆菌中的可溶性表达。方法:首先通过pcr的方法获得eh的cdna,pcr产物连接入原核表达载体pet-22或pet-24中获得重组表达质粒,将重组表达质粒转化大肠杆菌bl21(de3)或bl21(plyss),获得重组工程菌bl21(de3)-pet-24-eh,bl21(de3)-pet-22-eh,bl21(plyss)-pet-22-eh。重组工程菌进行iptg诱导,sds-page和westernblot鉴定表达产物。结果:eh在3个重组工程菌中均可实现可溶性表达。表达水平较高的为bl21(de3)-pet-24-eh工程菌;之后通过优化诱导温度,时间,诱导剂浓度、诱导前菌种密度,确定最佳条件为:37℃,诱导6h,iptg浓度为0.4μmol/l,诱导前菌种密度在od600=1左右。诱导产物经分离纯化,其纯度可达96.93%。最后通过蛋白含量测定及抗凝活性检测,确定表达的eh蛋白本身无抗凝活性,被fxa裂解后可以释放出水蛭素的抗凝活性。结论:实现了eh在大肠杆菌中的可溶性表达,表达周期短,有望提高eh的生产效率,为eh的产业化奠定了基础,也为水蛭素类产品的生产提供了新的工艺途径。