利用red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体

利用el350基因工程菌进行同源重组，成功进行基因敲除已有报道，但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguaninephosphoribosyltransferase，hprt)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。本实验首先在已经筛选到含有兔全长hprt基因bac克隆（lbnl1-304m19）的基础上，利用red重组系统，通过gap-repair方式从此克隆上将一段47kb无启动子的hprt基因组片段（不含有第1个外显子）克隆到pbaclinksp质粒上，产生pbaclinksp-rhprt质粒。然后基于pbaclinksp-rhprt质粒，设计不同的同源臂，从而删除了hprt基因的不同编码区，成功构建了三个不同的hprt基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的dna片段的效率进行了研究。基于本实验所构建的三个不同的兔hprt基因打靶载体，为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件，及进一步获得兔hprt基因敲除动物疾病模型奠定了基础。