质粒介导的ampcβ-内酰胺酶共有抗原表位的预测及原核表达

目的应用生物信息学方法预测质粒介导的ampcβ-内酰胺酶(pampcs)共有抗原表位，并实现pampcs共有抗原表位-trx融合蛋白的原核表达、纯化和鉴定。方法运用多序列比较工具找出各型质粒介导的ampcβ-内酰胺酶的共有相对保守区域，并利用分子生物学软件biosun预测各亚型pampcs的可及性、抗原性、抗原表位、柔性、亲水性等参数，通过综合分析后找出其共有的抗原表位区域pampcs1。根据大肠杆菌的密码子偏好性，把氨基酸序列pampcs1转变为核苷酸序列pampcs1，采用重叠延伸pcr合成pampcs1片断，并构建原核表达载体pet32a(+)/pampcs1。通过测序验证，对含有该重组质粒的大肠杆菌bl21(de3)进行诱导表达，表达产物经sds-page电泳分析后，用ni-nta亲和层析法纯化pampcs1-trx融合蛋白，利用westernblotting方法鉴定融合蛋白的抗原性。结果根据预测结果找到了一段各型pampcs共有的抗原表位区域pampcs1，成功构建了原核表达载体pet32a(+)/pampcs1，经iptg诱导后得到了分子量约为23kd的融合蛋白，经ni-nta亲和层析柱纯化后，通过westernblotting鉴定该蛋白能被抗ampcβ-lactamases多抗识别。结论成功构建了pampcs1-trx融合蛋白原核表达载体，并获得了高纯度的pampcs1-trx融合蛋白，初步证明它的抗原性，为制备特异性抗体及建立快速检测方法打下了良好的基础。