纤维连接蛋白肝素结合域多肽在昆虫表达系中表达及活性鉴定

目的：将纤维连接蛋白n端和c端两个肝素结合域基因片断克隆至昆虫表达系统中进行表达，分离纯化所表达多肽并进行多肽结合肝素、fn抗原性和抗血小板减少内毒素血症活性鉴定。方法：用高保真pcr技术从fncdna中扩增目的基因片段，将目的基因片段克隆至昆虫表达系的bac-to-bachtvector，在e.colidh5α中抗氨苄青霉素选择，挑选阳性菌斑通过pcr、酶切鉴定和dna序列测定，确定无误，再扩增提取质粒，进一步转染maxefficiencydh10bactmcompetente.coli，经三种抗菌素(卡那、庆大、四环素)联合iptg、x-gal蓝白斑选择，挑取阳性白色菌斑提取质粒，pcr、酶切鉴定和dna序列测定，确定无误，转染sf9昆虫细胞获取重组杆状病毒，重组杆状病毒再次转染sf9昆虫细胞表达多肽。裂解sf9昆虫细胞，sds-page分析裂解上清，镍离子亲和树脂分离纯化表达的多肽，western-blot鉴定多肽结合肝素和fn抗原性活性。动物实验探讨rhfnhc-36多肽抗血小板减少内毒素血症的作用。结果：纤维连接蛋白n端和c端两个肝素结合域多肽均在昆虫表达系统中得到表达，所表达的多肽具有与肝素结合的能力而不具fn抗原性。动物实验初步显示rhfnhc-36多肽具有抗血小板减少内毒素血症的作用。结论：在昆虫表达系统中表达纤维连接蛋白n端和c端两个肝素结合域多肽是可行的，所表达多肽具生物活性，但表达量尚较低，有待进一步优化表达以提高表达量。