改进重叠延伸pcr技术构建定点双突变

【目的】目的dna片段中快速构建位点不同的定点双突变体。【方法】借鉴dnashuffling技术中dna小片段延伸扩增获得全长dna片段的工作原理，与常规基因定点突变技术相结合，改进重叠延伸pcr技术构建定点双突变。【结果】对嗜酸热脂肪杆菌（alicyclobacillusacidocaldarius）tc-12-31的甘露聚糖酶基因aamana中两个可能的活性位点e151和e231进行双点突变，先后经过无引物和有引物两步pcr，扩增获得全长dna，测序结果表明得到预期的定点双突变体；酶活性检测和薄层层析结果表明双点突变体丧失了酶的活性。【结论】改良的重叠pcr技术，能经济、简便、高效地获得双点定点突变体，在酶的催化机理的阐述、蛋白质结构改造等分子生物学领域中具有较高的应用价值。