钝齿棒杆菌精氨酸琥珀酸酶编码基因argh的克隆表达及其重组菌发酵产精氨酸研究

钝齿棒杆菌（corynebacteriumcrenatum）sypa是本实验室筛选获得的一株高产精氨酸生产菌株。精氨酸琥珀酸酶（al）是精氨酸合成过程中的最后一个酶，催化底物精氨酸琥珀酸生成产物精氨酸。为进一步提高精氨酸产量，本文以钝齿棒杆菌基因组为模板，扩增得到其编码基因argh，全长为1434bp，编码476个氨基酸，理论蛋白分子量大小为50.8kda，其与c.glutamicumatcc13032比对其同源性为99.4%，相差10bp，3个氨基酸。将其在e.colibl21(de3)及c.crenatumsypa中成功表达。利用载体pet-28a上的6×his?tag选用ni柱亲和层析纯化al，纯化后获得的重组蛋白的比酶活达156.9mu/mg蛋白，总回收率为72.3%，对该酶的部分酶学性质进行了初步研究，并发现产物精氨酸对其具有反馈抑制作用。成功构建钝齿棒杆菌重组穿梭表达质粒pjc1-tac-argh并将其通过电击转化法转入c.crenatumsypa中，加强其代谢途径中al蛋白表达量，并对其发酵产精氨酸做了初步分析。结果表明与出发菌株相比，转化子在精氨酸琥珀酸酶酶活增强了66.8%的基础上精氨酸产量达40.9g/l，比出发菌株产量的35.8g/l提高了约14.2%。