多重pcr快速确证外源基因在转基因小麦后代的传递

根据转入小麦0世代中的高分子谷蛋白亚基1dx5基因和报告基因uida、作为选择标记的除草剂抗性基因bar的序列，设计合成三对引物。以整合uida+bar的质粒pahc25和整合1dx5的质粒p1dx5为模板寻找uida与1dx5及或bar多重扩增的最佳模板浓度及最适退火温度。mpcr模板量是单对引物扩增时的两倍，引物浓度同常规pcr为0.3μm，uida与bar的适宜退火温度范围为57.1-62.3℃；uida与1dx5为60.0℃-60.6℃；uida、bar、1dx5的最适合退火温度范围为57.0℃-58.4℃。mpcr对大小相差50bp及以下的多重扩增片段可通过10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在此基础上对14株t1代转基因小麦基因组dna进行多重pcr扩增，筛选出基因未分离的小麦后代，并与常规pcr比较，结果一致，其中11株同时传递1dx5和bar基因、1株同时传递uida、bar和1dx5基因，3株未检测到外源基因。表明mpcr在快速确证外源基因在转基因植株后代的传递中作用显著。研究在常规pcr反应体系上，对模板浓度和多重引物退火温度进行微调，且把mpcr技术与page技术结合起来，提高了研究结果的准确性，获得了较好的扩增和检测效果，简化了mpcr优化程序，使mpcr的优势更明显，为该技术的广泛应用提供了借鉴。