以结核杆菌hsp70为载体的“通用型”禽流感疫苗构建及免疫效力研究

化学合成h5n1亚型禽流感病毒m2蛋白n端胞外域基因序列3拷贝基因(3m2e),与人结核杆菌hsp70蛋白基因融合,克隆至原核表达载体pet-32a(+),构建表达载体pet-3m2e与pet-3m2e-hsp70。重组质粒转化大肠杆菌bl21,经iptg诱导重组蛋白获得表达,通过镍亲和层析获得纯化的融合蛋白,利用westernblot鉴定重组蛋白免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫20日龄的禽流感非免鸡,以人工合成的m2e与klh偶联后免疫鸡作为阳性对照,以pet-32a(+)载体蛋白注射组作为阴性对照，初免后2周加强免疫。通过抗m2e抗体检测、细胞病变抑制试验与间接免疫荧光试验评价重组蛋白免疫后产生的体液免疫反应;利用流式细胞分群及细胞因子产量检测评价重组蛋白免疫后产生的细胞免疫反应。加强免疫后4周用100eid50的h9n2亚型aiv攻毒,通过real-timepcr检测攻毒后3、5、7天免疫鸡泄殖腔棉拭子中病毒的含量。结果表明,重组蛋白3m2ehsp70免疫组能够刺激免疫鸡产生较高的抗体水平及细胞免疫应答,并且攻毒后泄殖腔棉拭子中病毒含量明显降低。