具蛋白酶抗性的armillariellatabescensβ-甘露聚糖酶man47的分子定向改造

利用定点突变的方法提高armillariellatabescensβ-甘露聚糖酶man47的胰蛋白酶抗性。首先根据其氨基酸序列,找到胰蛋白酶的水解位点—赖氨酸(lys,k)和精氨酸(arg,r),再利用生物信息学软件获得酶分子结构中k和r与周围溶剂的接触程度,选定暴露程度最大的k280为候选突变位点,进行模拟突变,并分析突变前后的氢键键长和整体结构的变化。根据氢键键长的变化,确定突变体为k280n。对k280n设计突变引物,用重叠延伸pcr技术对man47野生型man基因进行突变,pcr产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体pycα连接,在大肠杆菌dh5α中扩增后转入酿酒酵母saccharomycescerevisiae,经人工肠液(ph6.810mg/ml胰蛋白酶溶液)筛选,得到抗胰蛋白酶的最佳突变株。结果表明突变酶在用人工肠液处理180min后,其半衰期为173min,而野生型酶为99min,其他酶学性质与野生型酶基本一致。