vmip-ii-tfn融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建ppic-vmip-ii-tfn酵母表达载体,表达纯化vmip-ii-tfn融合蛋白。方法:利用pcr方法扩增编码人转铁蛋白n端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建ppic-vmip-ii-tfn酵母表达载体;电击法转化x33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、ni-nta层析等技术进行蛋白纯化,sds-page和westernblot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次pcr扩增了一个长约1.1kb的包含xbai酶切位点的igg3-tfn基因片段,插入ppic-vmip-ii的xbai酶切位点,经菌液pcr鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体ppic-vmip-ii-tfn的表达框正确无误,转化x33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kda的vmip-ii-tfn融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、ni-nta纯化后得到纯度约为95%的vmip-ii-tfn融合蛋白。western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vmip-ii-tfn融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建ppic-vmip-ii-tfn酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vmip-ii-tfn融合蛋白,纯化后的vmip-ii-tfn融合蛋白具有趋化抑制活性。