耐高温耐酸稳定假密环菌(armillariellatabescens)man47β-甘露聚糖酶体外分子定向进化

从已经建立的易错pcr初级突变文库中筛选得到的16个兼具耐酸、高温稳定、高酶活力的克隆出发,将其作为dnashuffling的亲本基因,利用dnashuffling技术,结合易化筛选和96微孔板通量筛选的方法获得耐酸、高温稳定的克隆。并且,对筛选出来的耐酸高温稳定的突变子进行测序分析和同源建模,比较分析β-甘露聚糖酶突变基因序列的生物学信息。经过两轮dnashuffling,最终筛选得到一个耐酸高温稳定突变体1108,其在90℃时酶活力还能维持在70%;在ph3.0时酶活力维持在70%;在高温80℃和ph4.0的条件下,酶活力是野生型的10倍;常规条件下(ph6.0,40℃),酶活力是野生型酶的5倍。序列比对发现耐酸、高温稳定突变体1108有三个碱基发生了改变(t289a、a535t、t1085c),导致相应的氨基酸发生了改变(ser97thr、val362ala、ile179leu)。根据同源建模结果和氨基酸性质研究发现,突变位点位于催化中心附近,推测第97位的突变与酶的耐酸性和活性有关,第179位和第362位的突变与酶的高温稳定性有关。实验结果为进一步了解β-甘露聚糖酶man47的结构与功能之间的关系提供有用参考。