猪髓样分化因子myd88特异性shrna干扰载体的构建筛选及干扰效果评价

髓样分化因子myd88(myeloiddifferentiationfactor88)信号通路是一个具有多种调节功能的传导通路,在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生和发展过程中均发挥重要作用。构建猪(susscrofa)myd88基因的shrna干扰载体,并在转录水平和蛋白质表达水平对其干扰效果进行验证,以筛选出干扰效果最优的干扰载体。根据猪myd88基因(genbank登录号:kc766424.1)全长cdna序列,利用invitrogen公司在线设计软件设计出4对shrna干扰序列,退火成双链后,分别将其插入到pyr-1.1载体中,构建myd88基因的shrna真核表达载体pyr-1.1-pigmyd88-sh1、pyr-1.1-pigmyd88-sh2、pyr-1.1-pigmyd88-sh3、pyr-1.1-pigmyd88-sh4,并通过双酶切和测序对其进行鉴定。构建成功后转染猪肺泡巨噬细胞3d4/2,通过real-timepcr及westernblot验证myd88基因的表达水平,以及对lps刺激后炎症因子tnf-α基因表达水平的影响。结果表明,所构建的猪myd88基因的特异性shrna表达载体均可显著降低猪myd88mrna和蛋白质的表达水平(p<0.05),干扰效率分别达到36%、67%、60%、69%;相比于未干扰组,lps刺激myd88沉默之后的巨噬细胞,炎症因子tnf-α基因表达水平显著下降(p<0.05),表明所构建猪myd88干扰载体干扰效果较好。