靶向nbs1基因的microrna真核表达载体的构建及其活性鉴定

目的:构建靶向nbs1基因的microrna真核表达载体,鉴定其转染宫颈癌细胞株hela后的生物活性?方法:根据nbs1mrna序列设计合成四对pre-microrna片段,定向克隆到pcdna6.2-gw/emgfp-mir真核表达载体上,并将其转染至hela细胞株中?采用菌落pcr和测序分析鉴定插入序列的完整性;采用实时定量pcr分析鉴定重组体对nbs1mrna表达的干扰效果以确定其生物活性?结果:构建的四组重组体插入片段的碱基序列完全正确?重组体能干扰hela细胞nbs1基因的表达,四组重组体nbs1mrna表达量分别为:0.24±0.17(nbs1mi-1组)?0.12±0.12(nbs1mi-2组)?0.41±0.97(nbs1mi-3组)?0.48±0.93(nbs1mi-4组),其中nbs1mi-2组表达最低?结论:构建的四组nbs1microrna重组体在hela细胞株中都具有生物活性,且nbs1mi-2组的干扰作用最强?载体构建成功,为应用microrna靶向nbs1的肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。