重组人钙网蛋白的克隆与原核表达

［摘要］目的:克隆人钙网蛋白（calreticulin，crt）并在e.coli中原核表达和纯化。方法：采用rt-pcr法从人非小细胞肺腺癌a549细胞总rna中克隆人钙网蛋白cdna，构建crt原核表达质粒（pet-15b/crt）并转化e.coli的rossetta菌株。iptg诱导后，表达蛋白在变性条件下经ni-nta树脂亲和层析纯化,然后透析复性。分别用sds-page和westernblotting法鉴定crt表达和纯化状态。结果：从a549细胞总rna中成功获得人crtcdna克隆，重组质粒pet-15b/crt构建正确。转化pet-15b/crt的e.colirossetta诱导性表达重组人crt蛋白，该蛋白可经ni-nta树脂亲和层析高度纯化。结论：成功建立了crt原核表达和纯化的实验方法，该方法为后续的crt蛋白功能研究奠定了基础。