杜氏盐藻rbcs启动子的克隆和功能分析

为提高转基因盐藻的表达效率，利用基因组步行方法和巢式pcr，从盐藻中克隆了1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（rubisco）的小亚基基因rbcs的5'上游调控序列，并对其进行序列分析和转基因功能分析。采用drai、ecorv、pvuii和stui四种平端限制内切酶分别酶切盐藻基因组dna，并与接头连接，构建基因组步行文库gwl1、gwl2、gwl3和gwl4；设计特异引物从这四种文库中扩增rbcs基因的5'上游调控序列。在gwl1、gwl4中分别扩增出约1.2kb的片段。对该序列的分析表明，它的3'端与已知盐藻rbcscdna的5'端序列完全一致，说明是该基因的5'端上游区，并且包含多个与转录调控有关的保守序列（如tata-box、caat-box），富含gt的重复序列。此序列ecori下游的片段与除草剂抗性基因bar相融合，构建表达载体，电击法转化盐藻。通过对转化藻株的抗性筛选以及pcr和southernblot检测，表明该区域能驱动外源基因bar在转基因盐藻中的表达，推断是盐藻rbcs基因的启动子调控区。