fgfr2iiic重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞l6中的表达

目的:构建人fgfr2iiic重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞l6表达人fgfr2iiic的重组细胞株,初步研究fgfr2iiic对l6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得fgfr2iiic基因,并克隆到gateway慢病毒系统的入门载体pentr-11,采用lr重组酶将重组的pentr-fgfr2iiic和表达载体plenti6/v5-dest进行重组反应得到plenti6/v5-dest-fgfr2iiic。将该重组表达载体和viralpackagingmix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293ft细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染l6细胞,杀稻瘟毒素筛选2~4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株。rt-pcr、间接免疫荧光和westernblot鉴定重组细胞株中目的基因fgfr2iiic的表达,bfgf和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组l6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系。结果:构建了含人fgfr2iiic基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染l6细胞,rt-pcr和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明l6中高表达fgfr2iiic的重组细胞株的g1/g0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化。结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达fgfr2iiic的重组l6细胞株,fgfr2iiic通过erk1/2和p38通路影响了l6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠l6细胞中研究fgfr2iiic基因与成肌分化功能相关性奠定基础。