弗氏柠檬酸菌dhat基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇（1,3-propanediol，1,3-pd）是一种重要的化工原料，越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(citrobacterfreundii)基因组dna为模板，通过pcr得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanedioldehydrogenase，pdor)的基因dhat，序列显示与来源于c.freundiidsm30040(genbanku09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pse380，得到重组质粒pse-dhat。重组质粒转化到宿主菌e.colijm109中进行了表达，重组酶通过镍柱及sephacrals-300进行纯化，重组酶sds-page结果显示有非常明显的单一的42kda特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适ph为8.0，对丙醛的km值为10.05mmol/l，最大反应速度vmax为37.27umol/min/mg；以1,3-pd为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适ph为10.5，对1,3-pd的km值为1.28mmol/l，最大反应速度vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50u/mg，氧化反应比活为79.72u/mg。该酶同样具有假定的结合fe2+的g-x-x-h-x-x-a-h-x-x-g-x-x-x-x-x-p-h-g模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-pd奠定了基础。