gln49-磷脂酶a2基因工程定点突变及酶活性分析

为了确认49位谷氨酰胺磷脂酶a2（glutamine49phospholipasea2,gln49-pla2）酶活性缺失与氨基酸序列的相关性，对gln49-pla2编码基因第49位氨基酸进行pcr定点突变，利用pet32a+质粒载体在大肠杆菌中表达gln49-磷脂酶a2的突变体--天冬氨酸磷脂酶a2（asparticacid49phospholipasea2,asp49-pla2--q49d-pla2）。将表达的包涵体蛋白变性，采用固定化金属离子亲和层析进行柱上复性、纯化获得突变体融合蛋白（fusionq49d-pla2--fq49d-pla2）；突变体融合蛋白经蛋白水解酶factorxa酶切后，采用hitrapsp阳离子交换层析和superdex75凝胶层析进一步纯化，得到突变体蛋白q49d-pla2，得率为1.3%，比酶活为72u/mg。从而证实gln49-pla2酶活性缺失的关键原因是49位氨基酸为谷氨酰胺。