牛呼吸道合胞体病毒核蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

利用牛呼吸道合胞体病毒(brsv)接种牛肺细胞(bl),提取病毒rna。通过rt-pcr扩增brsv的核蛋白基因,然后定向克隆到原核表达载体pet30a,获得重组表达质粒pet30a-n。将重组质粒转化表达菌bl21(de3),经增菌培养和iptg诱导以及sds-page和westernblot分析,成功表达出了核蛋白(n),其分子量约为49kda。为制备brsv核蛋白的单克隆抗体,用纯化的重组核蛋白免疫balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与sp2/0细胞融合。采用以brsv为检测抗原的间接elisa筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得2株稳定分泌抗n特异性mab的杂交瘤细胞株,分别命名为2d12与4b10。用2d12与4b10杂交瘤细胞株接种balb/c小鼠制备腹水,采用rn及brsv包被的elisa测得的效价分别是1×105和1×106及1×102和1×103。间接elisa、westernblot、ifa试验表明两株杂交瘤细胞所分泌的mab具有良好的反应性和特异性。经抗体亚类鉴定d12与4b10均为igg1/κ。特异性试验表明单抗2d12与4b10均不与牛副流感病毒3型和牛病毒性腹泻病毒反应。所制备的d12与4b10可用于建立检测brsv病原及抗体的诊断方法。