细胞穿透性重组酶tat-flpo的表达、纯化及活性检测

为了获得细胞穿透性的重组酶tat-flpe应用于基因重组研究,建立了高效稳定的tat-flpe原核表达与纯化体系。首先,以质粒pcaggs-flpe为模板,pcr扩增flpe序列,将其克隆到pet28a-tat中并与穿膜蛋白tat相连,获得表达载体pet28a-tat-flpe,然后将tat-flpe分别插入到另外3个原核表达载体pet22b、pet30a、pet32a中,转入原核表达菌rosetta诱导表达,结果发现只有载体pet32a-tat-flpe可在大肠杆菌中表达出稳定的、有活性的tat-flpe;在此基础上,为进一步提高tat-flpe的表达量,利用在线软件对tat-flpe的密码子进行了优化,发现优化后tat-flpe的表达量显著提高;另一方面还探索了诱导表达条件对tat-flpe表达的影响,发现tat-flpe转化菌的最佳诱导表达条件为0.05mol/liptg,30℃诱导表达4h。最后,采用阳离子交换柱纯化表达上清,获得细胞穿透性的tat-flpe,并通过质粒酶切实验及细胞实验验证了tat-flpe的体内体外活性。成功地在原核表达系统中获得了有活性的tat-flpe,并优化了其表达体系,为下一步应用于细胞及活体动物的基因操作奠定了基础。