利用原核表达系统一步法制备生物素标记蛋白质

传统的蛋白质生物素标记多采用体外化学修饰法，涉及生物素和蛋白质的活化、透析和纯化等多种处理，该方法步骤繁琐，且对目的蛋白的损失较大。本实验利用原核共表达质粒pcdfduet-1，将含有6个组氨酸标签的人己糖苷酶d（hexosaminidased，hexd）的cdna与生物素受体多肽（biotinacceptorpeptide，bap）dna进行pcr拼接，连入pcdfduet-1的多克隆位点1（multiplecloningsite1，mcs1）；将以大肠杆菌trans5α基因组为模板克隆得到的生物素连接酶（biotinligase，bira）基因连入mcs2，构建重组质粒pcdfduet-hexd-bap-bira。初步验证后将该质粒转化至大肠杆菌bl21（de3）plyss中，利用0.1mmol/l的iptg和80μmol/l的生物素进行诱导表达，采用ni-nta亲和层析和超滤对hexd进行纯化，sds-page检测分子量的大小（60kda）和纯度（90%以上）。以anti-hexd和链霉亲和素-hrp为抗体，westernblot检测发现，hexd-bap表达正确，且被生物素标记；同时以4-mu-o-galnac为荧光底物，检测到生物素化标记hexd的糖苷酶活性为3.6nmol/（min·μg），与未标记hexd的活性（3.06nmol/（min·μg））相当。结果表明，可以利用bira及其受体多肽，通过共表达质粒pcdfduet-1，一步转化、表达和纯化，在大肠杆菌中进行外源蛋白的表达和生物素标记，且不改变目的蛋白的生物活性，可应用于免疫标记、互作蛋白的捕获等生物学研究。