momlvgag-pol基因在nih3t3细胞中的表达和鉴定

目的构建含momlvgag-pol基因的重组表达载体，实现其在nih3t3细胞中稳定表达。方法应用rt-pcr方法反转录并扩增gag-pol基因，克隆入真核表达载体pcdna4/hismaxa上，构建重组表达载体pcdna4/hismaxa-gag-pol,用脂质体法转染nih3t3细胞,zeocin筛选稳定表达细胞株,通过sds-page分析检测表明,gag-pol基因在nih3t3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kd)为194.78×103。然后，将逆转录病毒载体导入此细胞系，包装逆转录病毒。用pcr与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果酶切鉴定的片段大小分别为5.2-kb，与预期大小一致，经zeocin筛选后获得稳定表达细胞株，sds-page实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kd)为194.78×103，与预期相符。脂质体转染包装细胞，嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106cfu/ml)的细胞克隆，且未检测到辅助病毒。结论本工作构建的融合表达载体pcdna4/hismaxa-gag-pol及其在nih3t3细胞中的表达，构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系，该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒，为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。