热稳定α-半乳糖苷酶基因在毕赤酵母中的分泌表达及酶学性质研究

克隆前期筛得分枝犁头霉absidiaramosawl511的热稳定α-半乳糖苷酶cdna基因aga（genbankno.dq234280），将aga基因插入表达载体ppiczαa并电转化整合到毕赤酵母p.pastorisgs115的染色体上。30℃、甲醇流加量0.5%（v/v）时，酵母发酵上清液中酶活达32u/ml。纯化后酶的比活力为137u/mg，sds-page显示单一条带，凝胶过滤和sds-page估算其分子量分别为348kda和87kda，该酶为四聚体结构，糖基化导致重组蛋白的分子量比原酶大6kda。该酶等电点为5.2，最适反应温度73℃，最适ph6.8，60℃以下及ph5.5-9.0范围内活性稳定。75℃时保温2小时保留54%的酶活，85℃时酶活完全消失。以对硝基苯酚-α-d-半乳糖苷为底物，该酶km值为0.42mmol/lol/l；vmax为413umg-1；kcat为64531min-1。