核苷二磷酸激酶a的定点突变及c4s突变体的制备和活性研究

目的：对核苷二磷酸激酶a(ndpk-a)二硫键异构的关键残基c4进行定点突变，构建、表达并纯化c4s突变体，测定其磷酸转移酶活性和dnase活性，研究二硫键异构对ndpk-a活性的影响。方法：以pbv220-nm23-h1质粒作为模板，通过设计合适的引物对ndpk-a进行定点突变，将第4位半胱氨酸突变为丝氨酸，构建ndpk-ac4s突变体；在大肠杆菌bl21中表达，deae-sepharosefastflow与cibacronblue3gasepharosecl-4b纯化目的蛋白，获得均一重组蛋白，纯度达到98%；dna序列测定及重组蛋白的肽质量指纹图谱（pmf）分析均证明构建正确突变体；高效液相色谱法(hplc)与dna消化法分别测定野生型ndpk-a与c4s突变体的磷酸转移酶活性与dnase活性差异。结果：ndpk-ac4s突变体的磷酸基转移酶与dnase酶活性均高于野生型ndpk-a。结论：ndpk-a[﹡国家自然科学基金(30873082),国家科技支撑计划(2008bai63b05),教育部新世纪优秀人才支持计划(ncet-07-0376)，暨南大学211计划。﹡﹡通讯作者，tel:86-020-85220504;fax:86-020-85220504;e-mail:xiongsheng@jnu.edu.cn]缺失二硫键后，活性增高。ndpk-a形成链内二硫键可能是其活性负调控模式之一。