tat-afgf融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其生物活性测定

构建表达tat与人酸性成纤维细胞生长因子（acidicfibroblastgrowthfactor,afgf）融合蛋白的重组质粒pet3c–tat-afgf14-154和pet3c-tat-afgf27-154，并转化大肠杆菌bl21（de3）中。37℃，lmmol/l的iptg诱导4hrs后，获得分子量约为18kda的融合蛋白，表达量分别占菌体总蛋白的42%和24%。利用阳离子交换（cm-sepharoseff）、肝素亲和层析（heparin-sepharosecl-6b）以及分子筛（sephadexg-25）联用的方法可获得纯度大于95%的目的蛋白，得率分别为93和78mg/l。tat-afgf14-154及其对照蛋白afgf14-154对balb/c3t3细胞有明显促细胞增殖的作用，最佳作用浓度分别为1280ng/ml和160ng/ml。而tat-afgf27-154及其对照蛋白afgf27-154则几乎没有促细胞增殖活性。免疫荧光分析结果表明，tat-afgf14-154及tat-afgf27-154均能穿过pc12、balbc/3t3、hacat和海马神经元细胞的细胞膜，并主要定位于细胞浆中。此外，四种重组蛋白均能降低aβ25-35对大鼠海马神经元细胞的毒性，在剂量为1000ng/ml时，tat-afgf14-154、tat-afgf27-154、afgf14-154及afgf27-154细胞存活率分别为90.66%、81.87%、85.71%和78.02%，而aβ25-35模型组的存活率仅为56.87%。