重组蛋白tat-nls-nkx6.2在大肠杆菌的表达纯化及活性测定

目的:构建重组基因tat-nls-nkx6.2的原核表达载体,获得重组tn-nkx6.2蛋白,并验证其生物学活性。方法:该实验先将人类免疫缺陷病毒hiv-1的反式激活因子tat、核定位信号nls、nkx6.2基因片段连接合成目的基因tat-nls-nkx6.2。之后构建重组质粒pet-28a-tn-nkx6.2并将其转化入e.colidh5α中克隆,再转化至e.colibl21(de3)中用iptg诱导表达,经组氨酸ni2+亲和层析纯化融合蛋白,并用sds-page及westernblot鉴定融合蛋白,荧光免疫组化染色观察tn-nkx6.2在小鼠脑组织分布。结果:成功表达并获得纯度90%以上的tn-nkx6.2蛋白,经westernblot鉴定,tn-nkx6.2有良好的免疫原性和免疫反应性荧光免疫组化染色证明tn-nkx6.2与小鼠大脑细胞结合并内化进入胞浆及胞核。结论:获得的融合蛋白tn-nkx6.2具有生物学活性,并能穿过血脑屏障与小鼠大脑细胞结合,并内化进入胞核和胞浆,为深入探讨同源盒基因nkx6.2在甲状腺减低模型的分子机制研究奠定了物质基础。