大肠杆菌ii型丙酮酸激酶的纯化分析及其作为偶联酶的应用

目的:分析大肠杆菌ii型丙酮酸激酶(pyruvatekinaseii,pkii)的酶学特性及其作为偶联酶的可行性。方法:pcr法从大肠杆菌基因组克隆pkii,构建入原核表达载体pskb4,经iptg诱导表达、纯化获得pkii。利用乳酸脱氢酶偶联法分析其催化adp、gdp、udp、cdp磷酸化的能力以及不同ph、温度对其活性的影响,并利用pkii作为偶联酶对球形红细菌硫酸盐活化复合体(sulfateactivatingcomplex,sac)及其突变体进行了活性分析。结果:原核表达、纯化、分析大肠杆菌pkii,发现其对adp、gdp、udp的催化效率与兔肌肉pk类似,且由大到小分别为:a>g>c>u;而对cdp的催化效率为兔肌肉pk的6倍。pkii的最适ph为7.0,在20~50℃范围内活性稳定,且18个月的－80℃低温及24hr的室温存放基本不影响其活性。pkii的高催化效率以及稳定性表明其可作为偶联酶进行ndp的测定。利用pkii作为偶联酶对球形红细菌sac及其突变体的活性测定表明s410和k409参与了5'-腺苷磷酰硫酸的磷酸化。