体外rna干扰下调deptor表达对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响

目的:研究探讨应用rna干扰技术构建人deptor基因的shrna慢病毒载体,鉴定在多发性骨髓瘤rpmi-8226细胞上的沉默效果,并评价deptor对人多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡能力的影响。方法:设计4个deptorsirna序列,化学合成后退火形成双链,克隆到酶切的hu6-mcs-cmv-egfp(gv115)-shrna慢病毒载体。重组质粒经pcr测序鉴定后,脂质体介导下转染293t细胞,westernblot检测deptor的表达,筛选出干扰效果最佳的gv115-shrna。将筛选的gv115-shrna与慢病毒包装质粒共转染293t细胞生成病毒,收集病毒上清并浓缩,测定浓度。将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤rpmi-8226细胞,应用real-timepcr方法从mrna水平及westernblot方法从蛋白水平检测deptor的沉默效果。运用四甲基偶氮唑蓝(mtt)法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化;流式细胞仪检测细胞凋亡;用westernblot分析cleavedcaspase-3和cleavedparp的变化。结果:构建的慢病毒载体shrna的pcr鉴定和测序正确,成功筛选出最有效抑制deptor表达的shrna2序列,包装病毒后滴度达到1×109tu/ml。慢病毒感染rpmi-8226细胞后可表达egfp,real-timepcr和westernblot检测deptor的表达明显下降。下调deptor基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度(p<0.05),肿瘤细胞的凋亡率上升(p<0.01)。deptorshrna上调cleavedcaspase-3、cleavedparp和bax表达,下调bcl-2及pi3k/akt信号通路的表达(p<0.01)。结论:成功构建了deptorshrna重组慢病毒载体,其转染多发性骨髓瘤rpmi-8226细胞后显著抑制了deptor的表达。deptorshrna可以有效地诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并抑制肿瘤细胞的增殖。pi3k/akt信号通路可能参与了其凋亡过程。