人表皮角质形成细胞自噬功能细胞模型的构建及鉴定

目的:建立稳定表达gfp-lc3的人永生化角质形成细胞hacat细胞系。方法:将构建的pcdna3.1-gfp-lc3真核表达载体转入hacat细胞,经g418筛选稳定表达的细胞系。hacat细胞中gfp-lc3的表达分别用荧光显微镜与westernblot方法检测,并利用该稳定表达的细胞系观察验证rapamycin对细胞发生自噬透射电镜超微结构的变化。结果:获得了3株转染并经g418反复筛选的hacat细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光细胞的表达率在95%以上,westernblot结果证实了gfp-lc3融合蛋白的表达。westernblot和激光共聚焦显微镜均证明rapamycin可以诱导自噬的发生。透射电镜细胞超微结构的观察表明rapamycin可以有效地诱导hacat-lc3细胞自噬的发生。结论:成功构建gfp-lc3稳定表达的hacat系,该细胞系可以作为研究人角质形成细胞自噬功能的一种细胞模型。