人胱硫醚β-合酶及其截短型片段的表达、纯化和活性测定

将人胱硫醚β-合酶(cbs)基因克隆至质粒pgex-4t-1中,获得的重组质粒pgex-4t-1-cbs转入大肠杆菌e.colirosetta(de3)菌株,构建了高效表达cbs的重组菌e.colirosetta(pgex4t-1-cbs)。重组菌在0.1mmol/l的iptg于30℃诱导16h,可溶性cbs表达量达到28mg/l培养基。将重组菌破碎后上清液经gstrapfastflow亲和层析一步纯化得到cbs融合蛋白,在凝血酶柱上切割缓冲液中加入3%甘油和0.1%chaps可以有效抑制酶切后cbs聚沉,酶活性回收率为54.8%,蛋白质产率为15.2mg/l培养基,纯度达到95%,单位酶活为143u/mg,终浓度为1mmol/l的s-腺苷甲硫氨酸(adomet)可使cbs单位酶活提高5.1倍,达到735u/mg。同时构建了表达cbs1-413(删除了cbs羧基端调控域138个氨基酸残基)的重组菌e.colirosetta(petduet-1-cbs1-413),经过一步histrapfastflow亲和层析,酶活性回收率为74.3%,蛋白质产率为12.8mg/l培养基,纯度达到95%,单位酶活为965u/mg;还表达和纯化了胱硫醚β-裂解酶(cbl),并在此基础上建立了一种新的cbl偶联的cbs酶活性测定方法。