抗血管内皮生长因子受体2双价单链抗体的构建表达及其活性研究

为了竞争性抑制血管内皮生长因子(vegf)与其受体(vegfr-2)的结合,构建表达了能够与vegfr-2胞外3区(kdr3)特异结合的双价单链抗体(bivalentsingle-chainfv,bsfv),并鉴定其生物活性。以kdr3特异结合单链抗体ak404(scfvak404)基因为模板,设计引物引入中间连接肽(g4s)3连接两个scfv片段,将其克隆入原核表达载体pet22b,并转化至大肠杆菌bl21(de3)中诱导表达,表达产物依次经过镍柱亲和层析纯化和透析复性;基于生物膜层表面干涉技术(bio-layerinterferometry,bli)技术的体外亲和力监测实验和vegf诱导的人脐静脉内皮细胞(huvec)增殖实验鉴定表达产物与kdr结合的活性。酶切鉴定和dna测序结果表明bsfv构建成功;sds-page显示37℃下1mmol/liptg诱导细菌6h获得包涵体,经镍柱亲和层析纯化和透析复性得到纯度为90%的bsfv;经westernblotting鉴定为目的蛋白;体外结合实验表明:bsfv特异性结合kdr胞外3区的亲合力约为单价抗体ak404的2倍;内皮细胞增殖抑制实验表明:bsfv可剂量依赖性地抑制huvec细胞增殖,且其抑制效果强于ak404。上述结果表明:bsfv在抗血管生成活性方面比其scfv具有明显优势,为进一步用于抗血管生成抗肿瘤治疗和肿瘤诊断奠定了基础。