限制性内切酶notⅰ提纯的新工艺

目前有关限制性内切酶notⅰ的性质特征及功能机制等方面的研究日渐增多,但商品化notⅰ及某些限制性内切酶的价格依然居高不下,其主要原因在于表达量低、提纯程序繁琐、得率低等问题的存在。为探索限制性内切酶notⅰ提纯的新工艺,从豚鼠耳炎诺卡菌(nocardiaotitidis-caviarum)中克隆出限制性内切酶notⅰ的基因并使之在大肠杆菌中高效表达。首先将由成团肠杆菌(enterobacteragglomerans)中克隆所得甲基化酶eagⅰm(eagⅰmethylasegene)基因连接到pbr322载体上,转化大肠杆菌er2566,将豚鼠耳炎诺卡菌中克隆所得的限制性内切酶notⅰr(notⅰrestrictionendonucleasegene)基因连接到表达载体pacyc184-pt7上,将此重组质粒转化到上述已转入甲基化重组质粒pbr322-eagⅰm的er2566中,构建成notⅰ蛋白表达菌er2566。重组工程菌经iptg诱导可表达限制性内切酶notⅰ,并对诱导条件进行优化使之以可溶形式高效表达。应用ktapurifier100蛋白纯化系统,对纯化工艺进行创新,通过deaesephroseff离子交换层析、phenylhp疏水层析和superdex7510/300gl分子筛层析对蛋白进行提纯。纯化后notⅰ经酶活力及纯度鉴定,其比活力为1.37×106u/mg,提纯35倍,得率为17.8％,产量达9.8×106units/gwetcell,提纯时间缩减为原来的1/10,在产量和效率上较以前报道均有很大提高。该纯化工艺的新方法,为实验室制备及工业化生产ⅱ型限制性内切酶提供了进一步的借鉴。且该酶的成功获得为后续研究提供了材料,为更多新发现内切酶的成功克隆提供了参考。