弧菌三联融合毒素基因表达及elisa检测方法建立

采用柔性linker(ggggs)和重叠延伸pcr方法将三个毒素基因,即副溶血性弧菌的耐热型直接溶血素基因tdh、创伤弧菌的溶细胞毒素基因vvha和拟态弧菌的热不稳定型溶血素基因vmha的成熟蛋白基因片段进行串联,得到三联融合毒素基因tdh-vvha-vmha(命名为ft)。一致性比对分析与预计融合的基因序列一致性为99.6%。ft的开放阅读框架全长3225bp,编码1074个氨基酸残基,预测分子量为120.4kda。将ft亚克隆至表达载体pet-22b(+)中,再转化至e.colibl21(de3)中进行表达,经sds-paeg分析,融合蛋白分子量与预测的相符。终浓度为1mmol/l的iptg,37℃诱导4h,融合毒素蛋白表达量最高,经薄层扫描分析,此时融合毒素蛋白占全菌体蛋白的11.49%。融合毒素蛋白包涵体经纯化,免疫豚鼠制备血清抗体,确定间接elisa的最佳工作条件,并进行敏感性、特异性、重复性及模拟样品检测试验,建立了食物中毒性弧菌广谱、快速、特异的同步免疫学检测方法。