ship基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究

构建真核表达载体pcag-ires-ship-gfp，并观察其在k562细胞中的表达。将ship逆转录聚合酶链反应（rt-pcr）产物克隆入pcag-ires-gfp，经酶切、pcr鉴定及测序分析，构建pcag-ires-ship-gfp重组真核表达载体；采用脂质体转染法将pcag-ires-ship-gfp及空载体转入k562细胞，实时荧光定量pcr（fq-pcr）、westernblot方法检测转染前后k562细胞中shipmrna和蛋白的表达及akt磷酸化水平改变，mtt、流式细胞仪检测等方法观察野生型ship基因表达对白血病细胞k562凋亡的影响。结果显示重组后的pcag-ires-ship-gfp质粒已成功载入ship的全长编码基因，序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pcag-ires-ship-gfp的k562细胞中存在荧光分布。外源性ship基因表达能使k562细胞增殖受抑；westernblot检测提示k562细胞akt308和akt473的磷酸化水平为较转染前显著下调，分别为转染前的38.7%和36.8％（p＜0.01）。上述结果表明基因全长3.5kb的人野生型ship基因真核表达载体质粒pcag-ires-ship-gfp构建成功，并在k562细胞中表达；外源性ship基因表达能使k562细胞凋亡增加；这些改变可能与p-akt表达下调有关。