重组角质细胞生长因子-1在杆状病毒表达系统中的表达及其生物活性研究

目的:利用杆状病毒载体表达系统(baculovirusexpressionvectorsystem,bevs)表达重组角质细胞生长因子-1(kgf-1),并对其进行鉴定纯化及活性测定。方法:pcr扩增角质细胞生长因子-1基因(kgf-1)序列,克隆到pfastbac杆状病毒转座载体,经酶切测序鉴定出阳性重组转座载体pfastbac-kgf1后,转化含有穿梭载体bacmid的dh10bac感受态细胞,蓝白斑筛选出阳性质粒bacmid-kgf1,转染spodopterafrugiperda(sf9)昆虫细胞。对收获的蛋白进行sds-page、westernblot鉴定。利用肝素亲和层析柱和阳离子交换柱对目的蛋白进行纯化,baf3细胞检测细胞增殖活性,并利用c57bl/6小鼠检测促毛囊增殖活性。结果:分子量约21kda的kgf-1在昆虫细胞中实现了表达。病毒侵染细胞48h时开始表达目的蛋白,到96h时表达量达到最高;且感染复数multiplicityofinfection(moi)为4时表达量较好。经过纯化之后,蛋白纯度达到90%以上,蛋白产量达2mg/l。纯化之后的蛋白对转染fgfr2ⅲb的baf3细胞在0.10ng/ml-1.56ng/ml之间有促增殖活性,呈剂量依赖关系。并且kgf-1处理后小鼠毛囊增殖效果有所加强。