蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂的酵母表达及其对b16细胞体外侵袭的抑制作用*

目的：建立毕赤酵母表达质粒ppiczαa-cystatin，转化酵母细胞生产重组蛋白，探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂（sv-cystatin）对肿瘤侵袭的生物学作用。方法：利用pcr扩增技术从puc18/sv-cystatin质粒中扩增sv-cystatincdna并克隆至酵母表达载体ppiczαa上，构建重组质粒ppiczαa-cystatin电激转化pichiapastori酵母细胞gs115，经1%甲醇诱导获得稳定表达的重组蛋白，改良boyden小室分析重组sv-cystatin蛋白处理对b16f1细胞体外侵袭力的影响。结果：sds-page检测和westernblot分析显示分泌表达的sv-cystatin重组蛋白相对分子量约为14kd，摇瓶发酵每升发酵培养上清可获得16mg的重组蛋白，经亲和层析纯化获得的sv-cystatin重组蛋白具有抑制木瓜蛋白酶的活性。改良boyden小室实验结果显示：经0.5mg/ml浓度的重组蛋白处理的b16f1细胞穿过matrigel的细胞数明显低于对照组(52.60±4.58，106±5.9，p<0.01)，抑制率为50%。结论：成功实现sv-cystatin的酵母表达，初步证明sv-cystatin重组蛋白可抑制小鼠b16f1细胞体外侵袭作用。