人脑乙酰胆碱酯酶(hache)基因在毕赤酵母中的分泌表达与鉴定

研究了hache基因在毕赤酵母中的表达。设计并合成引物pb1和p2,以18周龄引产胎儿大脑组织mrna为模板,经amv逆转录和高保真pcr,扩增出序列正确的hache成熟肽完整基因约1．8kb,经鉴定获得正确构建的分泌型酵母表达栽体phil-s1(hache),bglⅱ线性化后回收的酵母表达单位经电穿孔法转化入毕赤酵母gs115中,经md／mm营养表型筛选、提取酵母基因组进行pcr鉴定和含3-酰基吲哚培养基进行表达产物的显色反应,初步筛选出分泌表达有hache活性的p．patstoris菌22株。依据hache酶活性与3-酰基吲哚显色深浅成正比,在平皿和微量反应板上快捷地筛选出高效表达菌phil-s1(ache)(ⅰ)-7株,sds-page分析和western印迹试验表明,产物分子量约为65kda,经甲醇诱导摇瓶培养,发酵上清原液rhache相对酶活性高达4．0mu／ml,表达量占分泌蛋白总量的23．6％。