苦瓜map30蛋白基因克隆、表达及其抗肿瘤活性研究

通过pcr技术,从苦瓜总dna中扩增出编码map30成熟蛋白的基因,经测序鉴定后亚克隆到原核表达载体pet30a中,构建成带有n端6histag的融合表达载体。表达载体用cacl2介导的化学转化法转化e.colibl21(de3),然后利用pcr筛选阳性克隆。工程菌经1mmol/liptg诱导4h实现高效表达,而且在30℃时融合蛋白表达量最高,约占菌体总蛋白56%。可溶性分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中主要以可溶的形式存在。重组蛋白通过ni2+鏊合亲和层析进行纯化,纯化蛋白占上清总蛋白37.2%,发酵液产率为250mg/l。westernblot分析表明,重组蛋白可与兔抗histag多克隆抗体发生特异性反应。利用mtt法分析重组map30的细胞毒性,结果表明其对小鼠3t3和s180肿瘤细胞株具有明显的抑制作用,id50分别约为50μg/ml和30mg/ml,而对人正常胚肺二倍体wi38细胞株的毒性极小。