黄病毒检测工程细胞系的构建及功能鉴定

目的:构建黄病毒检测工程细胞系并对其功能进行鉴定.方法:以含有登革4型病毒814669株全长感染性克隆的质粒p4质粒为基础,缺失prm-e基因1945bp,构建含有红色荧光蛋白mcherry报告基因的登革病毒复制子载体p4-△prme-mcherry.以p4-△prme-mcherry为基础,通过融合pcr方法,以真核表达载体pcdna3.1+为骨架,构建用于黄病毒检测细胞筛选的缺陷型真核表达质粒pcdna3.1-p4-mcherry.脂质体转染法将质粒pcdna3.1-p4-mcherry转染bhk-21细胞,g418进行筛选,获得的阳性细胞克隆经96孔板系列稀释筛选、纯化克隆细胞bhk-flavivirus.结果:bhk-flavivirus细胞感染登革病毒60h后,能够在荧光显微镜下检测到红色荧光蛋白mcherry的表达,说明bhk-flavivirus能够用于外源黄病毒的检测.bhk-flavivirus细胞分别感染黄病毒属的乙脑病毒(p3)、4型登革病毒(p4),可以检测到红色荧光;而辛德毕斯病毒(xj-160)、和基孔肯雅病毒(sd08pan)、盖塔病毒(hb0234)等正链rna病毒感染后则不出现红色荧光.结论:以上结果表明bhk-alphavirus细胞可用于未知蚊媒黄病毒检测,该方法通过报告基因表达与否,能够高效、特异的甄别主要蚊媒甲病毒和黄病毒,同时该方法有利于稀缺病毒的分离、保存,操作方法简单、直观,有望应用于临床检测及病毒性生物战剂的早期甄别.