共表达sirna和hil-12的新型乙肝多表位dna疫苗的研究

目的构建含有靶向乙肝表面抗原(hbsag)基因的sirna、乙肝复合多表位抗原基因和hil-12共质粒表达的新型dna疫苗，并在hepg2细胞中检测sirna的效果以及各基因的表达。方法设计并合成复合多表位hbv抗原基因，将其与增强型绿色荧光蛋白（egfp）基因融合克隆进真核表达载体pvax1的多克隆位点中，同时将带cmv启动子的完整hil-12表达单元克隆进载体的bsphi位点之间，再设计并合成乙肝sirna表达单元，将其克隆进载体的mlui位点之间，得到真核三元共表达重组质粒pvax1-sihb-hb-egfp-hil12。以该重组质粒瞬时转染人肝癌细胞系hepg2，通过egfp的荧光标记观察多表位抗原的表达，以elisa测定培养细胞上清中hil-12的表达，以rtpcr检测sirna对hbsag基因的沉默效果。结果经酶切鉴定和测序证实共表达sirna、hil-12的hbv多表位dna疫苗构建成功。转染细胞中检测到绿色荧光，证实抗原表达；转染后48hhil-12的检出量为1289pg/ml细胞上清，72h检出量为1712pg/ml细胞上清；转染后hbsag表达量明显降低，证实sirna效果良好。结论成功构建乙肝复合多表位抗原基因与sirna、hil-12共质粒表达的dna疫苗，并能在真核细胞中有效表达抗原与hil-12基因，而且sirna对hbsag显示出明显的沉默效果。我们的工作为进一步研究该复合型dna疫苗抗hbv的治疗效果打下基础。