粘虫核型多角体病毒919bp片段的pcr双链直接序列测定

本文发展了ｐｃｒ克隆和亚克隆技术制备ｄｎａ测序模板。首先，我们用ｐｕｃ／ｍ１３系列质粒的通用正反向引物ｐｃｒ扩增出质粒ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔｋｓｄｎａ的多克隆位点及其侧翼序列，用ｅｃｏｒｖ和ｘｈｏｉ消化成为左右两个引物多克隆臂，与粘虫核型多角体病毒（ｌｓｎｐｖ）的ｅｃｏｒｖ和ｘｈｏｉ约４００ｂｐ和５００ｂｐ片段分别连接，经ｐｃｒ扩增，得到两端具有上述正反向引物结合位点的测序模板，用ｄｄｎｔｐ链终止法／ｐｃｒ扩增／银染色，从片段两端测定了全部９１９ｂｐ序列，这种ｄｄｎｔｐ／ｐｃｒ／银染测序法简化了操作，大大缩短了测序模板的制备时间，易于实现自动化操作。