无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhtrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定。方法:从人胚胎肾hek293细胞中提取总rna,反转录合成cdna,经pcr扩增、酶切后连入pet-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞,iptg诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用sds-page、westernblotting、hplc、maldi-tof-ms及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定。结果:构建成功了rhtrx基因表达载体;实现了rhtrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经sds-page和westernblotting分析证实为rhtrx;hplc和maldi-tof-ms分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95%;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhtrx具有生物学活性。结论:成功构建了rhtrx的原核表达体系,建立了rhtrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据。