人源tnfα的原核表达及活性测定

目的：利用sumo标签构建人tnfα原核表达载体，通过表达及纯化获得重组蛋白，为深入研究和利用人tnfα奠定基础。方法：利用pcr技术，从质粒pet32a-htnfα中扩增出人tnfα成熟肽编码序列，并在其上游添加sumo标签，与原核表达载体pet28a连接，构建表达质粒pet28a-sumo-htnfα。在bl21（de3）工程菌中表达融合蛋白，经ni-nta纯化体系纯化，切除sumo标签，纯化获得htnfα成熟蛋白。cck-8法检测tnfα对l929细胞的细胞毒性，以测定tnfα的生物学活性。结果：成功构建pet28a-sumo-htnfα原核表达质粒，酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在bl21（de3）工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得htnfα成熟肽。cck-8法检测得所制备的tnfα蛋白ed50约为12.8μg/ml。结论：成功构建原核表达载体pet28a-sumo-htnfα，经表达、纯化、酶切及再纯化，获得有生物活性的htnfα蛋白，为深入研究和利用htnfα奠定基础。