醛脱氢酶基因敲除的k.pneumoniae重组菌的构建

在利用klebsiellapneumoniaem5al厌氧发酵甘油生产1,3丙二醇的过程中,一部分甘油通过氧化代谢途径经醛脱氢酶(aldh)催化合成大量副产物乙醇,降低了1,3丙二醇的产量和得率。首次以醛脱氢酶aldh为改造目标,利用同源重组技术获得了aldh基因敲除的k.pneumoniae重组菌。首先,采用pcr的方法分别从k.pneumoniaem5al基因组dna及质粒pbr322上扩增得到aldh基因和四环素抗性基因(tcr);然后将aldh基因定向插入到质粒puc18的多克隆位点得到中间载体puc18aldh,该载体与tcr基因分别用avai和bsaai双酶切后进行连接,得到aldh基因敲除的重组载体pucat;经dna测序及限制性酶切电泳分析,构建的载体由5′aldhtcr3′aldhpuc18组成,与设计结果相符;最后,利用该载体通过同源重组技术得到两株k.pneumoniae重组菌06231hb及06231hc,经菌落pcr及酶活鉴定,两株菌的aldh基因均已缺失。与出发菌株k.pneumonaiem5al相比,重组菌的乙醇合成浓度降低了43%～53%,1,3丙二醇合成浓度提高了27%～42%。