p53与端粒重复序列结合蛋白质1的体外相互作用

？目的:通过分析端粒主要结合蛋白中端粒重复序列结合蛋白质1(telomericrepeatbindingprotein1,trbp1)与p53的体外结合,探讨p53通过端粒途径调节细胞增殖、衰老和凋亡的分子机制.方法:谷胱甘肽s转移酶(glutathiones-transferase,gst)和人p53-gst融合蛋白经大肠杆菌表达、谷胱甘肽-sepharosetm4b纯化后,和人乳腺癌细胞mcf-7细胞蛋白进行体外结合反应(pulldown),westernblot检测反应物中p53和trbp1的结合.融合蛋白中人p53包括野生型(1～393)、c端缺失体p53n5(2～293)、n端缺失体p532c(95～393)、175单个氨基酸突变体p53r175h(r→h).结果:聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝r250染色显示,纯化的gst和4种p53-gst蛋白纯度在90%以上,且分子量与预计的完全一致.trbp1的westernblot显示,野生型p53和p53-r175h均能沉淀mcf-7中的trbp1,且结合力相似,而单独的gst则无沉淀trbp1的作用.与野生型p53和p53r175h相比,p532c与trbp1的结合力明显增加,p53n5与trbp1的结合力明显减弱.结论:p53和trbp1可以直接体外结合,p53的c端(293～393)是与trbp1结合的结构域.p53和trbp1结构域依赖性的结合可能与端粒动态变化所诱导的细胞活动有关.